Javascript je aktuálně ve vašem prohlížeči zakázán.Když je javascript zakázán, některé funkce tohoto webu nebudou fungovat.
Zaregistrujte své konkrétní údaje a konkrétní léky, které vás zajímají, a my vám poskytnuté informace spojíme s články v naší rozsáhlé databázi a včas vám zašleme kopii PDF e-mailem.
Ovládejte pohyb magnetických nanočástic oxidu železa pro cílenou dodávku cytostatik
Autor Toropova Y, Korolev D, Istomina M, Shulmeyster G, Petukhov A, Mishanin V, Gorshkov A, Podyacheva E, Gareev K, Bagrov A, Demidov O
Yana Toropova,1 Dmitrij Korolev,1 Maria Istomina,1,2 Galina Shulmeyster,1 Alexey Petukhov,1,3 Vladimir Mishanin,1 Andrey Gorshkov,4 Ekaterina Podyacheva,1 Kamil Gareev,2 Alexej Bagrov,5 Oleg Demidov6,71Almazov National Medical Výzkumné centrum Ministerstva zdravotnictví Ruské federace, Petrohrad, 197341, Ruská federace;2 Petrohradská elektrotechnická univerzita „LETI“, Petrohrad, 197376, Ruská federace;3 Centrum personalizované medicíny, Almazov State Medical Research Center, Ministerstvo zdravotnictví Ruské federace, Petrohrad, 197341, Ruská federace;4FSBI „Institut pro výzkum chřipky pojmenovaný po AA Smorodintsev“ Ministerstvo zdravotnictví Ruské federace, Petrohrad, Ruská federace;5 Sechenovův ústav evoluční fyziologie a biochemie, Ruská akademie věd, Petrohrad, Ruská federace;6 Cytologický ústav RAS, Petrohrad, 194064, Ruská federace;7INSERM U1231, Lékařská a farmaceutická fakulta, Bourgogne-Franche Comté University of Dijon, Francie Komunikace: Národní centrum lékařského výzkumu Yana ToropovaAlmazova, Ministerstvo zdravotnictví Ruské federace, Petrohrad, 197341, Ruská federace Tel +7 981 95264800 4997069 Email [email protected] Pozadí: Slibným přístupem k problému cytostatické toxicity je použití magnetických nanočástic (MNP) pro cílené dodávání léčiv.Účel: Pomocí výpočtů určit nejlepší charakteristiky magnetického pole, které řídí MNP in vivo, a vyhodnotit účinnost magnetronového dodávání MNP do myších nádorů in vitro a in vivo.(MNPs-ICG).In vivo studie intenzity luminiscence byly provedeny na myších s nádorem, s magnetickým polem a bez magnetického pole v místě zájmu.Tyto studie byly provedeny na hydrodynamickém lešení vyvinutém Institutem experimentální medicíny Státního lékařského výzkumného centra Almazova ruského ministerstva zdravotnictví.Výsledek: Použití neodymových magnetů podpořilo selektivní akumulaci MNP.Jednu minutu po podání MNP-ICG myším s nádorem se MNP-ICG hromadí hlavně v játrech.V nepřítomnosti a přítomnosti magnetického pole to naznačuje jeho metabolickou dráhu.Přestože bylo pozorováno zvýšení fluorescence v nádoru v přítomnosti magnetického pole, intenzita fluorescence v játrech zvířete se v průběhu času neměnila.Závěr: Tento typ MNP v kombinaci s vypočtenou intenzitou magnetického pole může být základem pro vývoj magneticky řízeného dodávání cytostatik do nádorových tkání.Klíčová slova: fluorescenční analýza, indocyanin, nanočástice oxidu železa, magnetronová dodávka cytostatik, tumor targeting
Nádorová onemocnění jsou jednou z hlavních příčin úmrtí na celém světě.Zároveň stále existuje dynamika rostoucí morbidity a mortality na nádorová onemocnění.1 Chemoterapie, která se dnes používá, je stále jednou z hlavních léčebných metod pro různé nádory.Vývoj metod ke snížení systémové toxicity cytostatik je přitom stále aktuální.Slibnou metodou, jak vyřešit problém s toxicitou, je použití nanonosičů pro cílené metody dodávání léků, které mohou zajistit lokální akumulaci léků v nádorových tkáních bez zvýšení jejich akumulace ve zdravých orgánech a tkáních.koncentrace.2 Tato metoda umožňuje zlepšit účinnost a zacílení chemoterapeutických léků na nádorové tkáně a zároveň snížit jejich systémovou toxicitu.
Mezi různými nanočásticemi uvažovanými pro cílené dodávání cytostatických činidel jsou magnetické nanočástice (MNP) zvláště zajímavé kvůli jejich jedinečným chemickým, biologickým a magnetickým vlastnostem, které zajišťují jejich všestrannost.Proto lze magnetické nanočástice použít jako topný systém k léčbě nádorů s hypertermií (magnetická hypertermie).Mohou být také použity jako diagnostická činidla (diagnostika magnetickou rezonancí).3-5 Pomocí těchto vlastností v kombinaci s možností akumulace MNP ve specifické oblasti, prostřednictvím použití vnějšího magnetického pole, otevírá dodávka cílených farmaceutických přípravků vytvoření multifunkčního magnetronového systému pro cílení cytostatik do místa nádoru Vyhlídky.Takový systém by zahrnoval MNP a magnetická pole pro řízení jejich pohybu v těle.V tomto případě lze jako zdroj magnetického pole použít jak vnější magnetická pole, tak magnetické implantáty umístěné v oblasti těla obsahující nádor.6 První metoda má vážné nedostatky, včetně nutnosti použití specializovaného zařízení pro magnetické zaměřování léků a nutnosti vyškolit personál k provádění operací.Tato metoda je navíc limitována vysokou cenou a je vhodná pouze pro „povrchové“ nádory blízko povrchu těla.Alternativní způsob použití magnetických implantátů rozšiřuje rozsah aplikace této technologie a usnadňuje její použití u nádorů lokalizovaných v různých částech těla.Jak jednotlivé magnety, tak magnety integrované do intraluminálního stentu mohou být použity jako implantáty pro poškození nádorů v dutých orgánech pro zajištění jejich průchodnosti.Ty však podle našeho vlastního nepublikovaného výzkumu nejsou dostatečně magnetické, aby zajistily zadržení MNP z krevního řečiště.
Účinnost podávání léčiva magnetronem závisí na mnoha faktorech: na vlastnostech samotného magnetického nosiče a na vlastnostech zdroje magnetického pole (včetně geometrických parametrů permanentních magnetů a síly magnetického pole, které vytvářejí).Vývoj úspěšné technologie dodávání buněčných inhibitorů magnetického vedení by měl zahrnovat vývoj vhodných magnetických nosičů léků v nanoměřítku, posouzení jejich bezpečnosti a vývoj vizualizačního protokolu, který umožní sledovat jejich pohyby v těle.
V této studii jsme matematicky vypočítali optimální charakteristiky magnetického pole pro řízení magnetického nosiče léčiv v nanoměřítku v těle.Možnost zadržení MNP přes cévní stěnu pod vlivem aplikovaného magnetického pole s těmito výpočetními charakteristikami byla také studována na izolovaných krevních cévách potkana.Kromě toho jsme syntetizovali konjugáty MNP a fluorescenčních činidel a vyvinuli protokol pro jejich vizualizaci in vivo.Za podmínek in vivo u myší s nádorovým modelem byla studována účinnost akumulace MNP v nádorových tkáních při systémovém podávání pod vlivem magnetického pole.
Ve studii in vitro jsme použili referenční MNP a ve studii in vivo jsme použili MNP potažený polyesterem kyseliny mléčné (kyselina polymléčná, PLA) obsahující fluorescenční činidlo (indolecyanin; ICG).MNP-ICG je součástí V případě, použijte (MNP-PLA-EDA-ICG).
Syntéza a fyzikální a chemické vlastnosti MNP byly podrobně popsány jinde.7,8
Aby bylo možné syntetizovat MNP-ICG, byly nejprve vyrobeny konjugáty PLA-ICG.Byla použita prášková racemická směs PLA-D a PLA-L s molekulovou hmotností 60 kDa.
Vzhledem k tomu, že PLA a ICG jsou obě kyseliny, je za účelem syntézy konjugátů PLA-ICG nutné nejprve syntetizovat amino-koncovou spacer na PLA, který pomáhá ICG chemisorbovat na spacer.Spacer byl syntetizován pomocí ethylendiaminu (EDA), karbodiimidové metody a ve vodě rozpustného karbodiimidu, 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimidu (EDAC).Spacer PLA-EDA je syntetizován následovně.Přidejte 20násobný molární přebytek EDA a 20násobný molární přebytek EDAC do 2 ml 0,1 g/ml PLA chloroformového roztoku.Syntéza byla prováděna v 15ml polypropylenové zkumavce na třepačce při rychlosti 300 min-1 po dobu 2 hodin.Schéma syntézy je znázorněno na obrázku 1. Opakujte syntézu s 200násobným přebytkem činidel pro optimalizaci schématu syntézy.
Na konci syntézy byl roztok centrifugován při rychlosti 3000 min-1 po dobu 5 minut, aby se odstranil přebytek vysrážených polyethylenových derivátů.Poté byly k 2 ml roztoku přidány 2 ml 0,5 mg/ml ICG roztoku v dimethylsulfoxidu (DMSO).Míchadlo se fixuje při rychlosti míchání 300 min-1 po dobu 2 hodin.Schematický diagram získaného konjugátu je znázorněn na obrázku 2.
Do 200 mg MNP jsme přidali 4 ml konjugátu PLA-EDA-ICG.Použijte třepačku LS-220 (LOIP, Rusko) k míchání suspenze po dobu 30 minut při frekvenci 300 min-1.Poté byl třikrát promyt isopropanolem a podroben magnetické separaci.Pomocí ultrazvukového dispergátoru UZD-2 (FSUE NII TVCH, Rusko) přidejte IPA k suspenzi po dobu 5-10 minut za nepřetržitého působení ultrazvuku.Po třetím promytí IPA byla sraženina promyta destilovanou vodou a resuspendována ve fyziologickém solném roztoku na koncentraci 2 mg/ml.
Ke studiu distribuce velikosti získaného MNP ve vodném roztoku bylo použito zařízení ZetaSizer Ultra (Malvern Instruments, UK).Pro studium tvaru a velikosti MNP byl použit transmisní elektronový mikroskop (TEM) s polní emisní katodou JEM-1400 STEM (JEOL, Japonsko).
V této studii používáme válcové permanentní magnety (třída N35; s niklovým ochranným povlakem) a následující standardní velikosti (délka dlouhé osy × průměr válce): 0,5×2 mm, 2×2 mm, 3×2 mm a 5×2 mm.
In vitro studie transportu MNP v modelovém systému byla provedena na hydrodynamickém lešení vyvinutém Institutem experimentální medicíny Almazova State Medical Research Center ruského ministerstva zdravotnictví.Objem cirkulující kapaliny (destilovaná voda nebo Krebs-Henseleitův roztok) je 225 ml.Jako permanentní magnety se používají axiálně magnetizované válcové magnety.Magnet umístěte na držák 1,5 mm od vnitřní stěny centrální skleněné trubice tak, aby jeho konec směřoval ke směru trubice (vertikálně).Průtok tekutiny v uzavřené smyčce je 60 l/h (odpovídá lineární rychlosti 0,225 m/s).Krebs-Henseleitův roztok se používá jako cirkulující tekutina, protože je analogem plazmy.Dynamický viskozitní koeficient plazmatu je 1,1–1,3 mPa∙s.9 Množství MNP adsorbovaného v magnetickém poli se stanoví spektrofotometrií z koncentrace železa v cirkulující kapalině po experimentu.
Kromě toho byly provedeny experimentální studie na vylepšeném stole mechaniky tekutin pro stanovení relativní propustnosti krevních cév.Hlavní součásti hydrodynamické podpory jsou znázorněny na obrázku 3. Hlavní součásti hydrodynamického stentu jsou uzavřená smyčka, která simuluje průřez modelového cévního systému a zásobní nádrž.Pohyb modelové tekutiny po obrysu modulu krevních cév zajišťuje peristaltické čerpadlo.Během experimentu udržujte odpařování a požadovaný teplotní rozsah a sledujte parametry systému (teplota, tlak, průtok kapaliny a hodnota pH).
Obrázek 3 Blokové schéma nastavení použitého ke studiu propustnosti stěny krční tepny.1-akumulační nádrž, 2-peristaltické čerpadlo, 3-mechanismus pro zavádění suspenze obsahující MNP do smyčky, 4-průtokový měřič, 5-tlakový senzor ve smyčce, 6-výměník tepla, 7-komorový s nádobou, 8-zdroj magnetického pole, 9-balón s uhlovodíky.
Komora obsahující kontejner se skládá ze tří kontejnerů: vnějšího velkého kontejneru a dvou malých kontejnerů, kterými procházejí ramena centrálního okruhu.Kanyla se vloží do malé nádobky, nádobka se na nádobku navlékne a špička kanyly se pevně sváže tenkým drátkem.Prostor mezi velkou nádobou a malou nádobou je vyplněn destilovanou vodou a teplota zůstává konstantní díky připojení k výměníku tepla.Prostor v malé nádobce je vyplněn Krebs-Henseleitovým roztokem, aby byla zachována životaschopnost buněk krevních cév.Nádrž je rovněž naplněna roztokem Krebs-Henseleit.Systém přívodu plynu (uhlíku) se používá k odpařování roztoku v malé nádobě ve skladovací nádrži a komoře obsahující nádobu (obrázek 4).
Obrázek 4 Komora, kde je umístěna nádoba.1-Kanyla pro snížení krevních cév, 2-Vnější komora, 3-Malá komora.Šipka ukazuje směr modelové kapaliny.
Pro stanovení relativního indexu permeability cévní stěny byla použita krční tepna potkana.
Zavedení suspenze MNP (0,5 ml) do systému má následující charakteristiky: celkový vnitřní objem nádrže a spojovacího potrubí ve smyčce je 20 ml a vnitřní objem každé komory je 120 ml.Vnějším zdrojem magnetického pole je permanentní magnet o standardní velikosti 2×3 mm.Instaluje se nad jednu z malých komor, 1 cm od nádoby, s jedním koncem obráceným ke stěně nádoby.Teplota se udržuje na 37 °C.Výkon válečkového čerpadla je nastaven na 50 %, což odpovídá rychlosti 17 cm/s.Jako kontrola byly odebrány vzorky v cele bez permanentních magnetů.
Jednu hodinu po podání dané koncentrace MNP byl z komory odebrán kapalný vzorek.Koncentrace částic byla měřena spektrofotometrem za použití spektrofotometru Unico 2802S UV-Vis (United Products & Instruments, USA).S přihlédnutím k absorpčnímu spektru suspenze MNP bylo měření provedeno při 450 nm.
Podle směrnic Rus-LASA-FELASA jsou všechna zvířata chována a chována ve specifických zařízeních bez patogenů.Tato studie je v souladu se všemi příslušnými etickými předpisy pro pokusy a výzkum na zvířatech a získala etické schválení od Almazov National Medical Research Center (IACUC).Zvířata pila vodu ad libitum a pravidelně se krmila.
Studie byla provedena na 10 anestetizovaných 12týdenních samcích myší NSG s imunodeficiencí (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/Szj, Jackson Laboratory, USA) 10 o hmotnosti 22 g ± 10 %.Protože imunita imunodeficitních myší je potlačena, imunodeficitní myši této linie umožňují transplantaci lidských buněk a tkání bez odmítnutí transplantátu.Sourozenci z různých klecí byli náhodně přiřazeni do experimentální skupiny a byli společně chováni nebo systematicky vystaveni podestýlce jiných skupin, aby byla zajištěna stejná expozice běžné mikrobiotě.
Lidská rakovinová buněčná linie HeLa se používá k vytvoření modelu xenograftu.Buňky byly kultivovány v DMEM obsahujícím glutamin (PanEco, Rusko), doplněném 10% fetálním bovinním sérem (Hyclone, USA), 100 CFU/ml penicilinu a 100 ug/ml streptomycinu.Buněčná linie byla laskavě poskytnuta Laboratoří regulace genové exprese Ústavu buněčného výzkumu Ruské akademie věd.Před injekcí byly HeLa buňky odstraněny z kultivačního plastu pomocí 1:1 roztoku trypsin:Versene (Biolot, Rusko).Po promytí byly buňky suspendovány v kompletním médiu na koncentraci 5 x 106 buněk na 200 ul a zředěny matricí bazální membrány (LDEV-FREE, MATRIGEL® CORNING®) (1:1, na ledu).Připravená buněčná suspenze byla injikována subkutánně do kůže myšího stehna.Použijte elektronické posuvné měřítko ke sledování růstu nádoru každé 3 dny.
Když nádor dosáhl 500 mm3, byl do svalové tkáně pokusného zvířete v blízkosti nádoru implantován permanentní magnet.V experimentální skupině (MNPs-ICG + tumor-M) bylo injikováno 0,1 ml suspenze MNP a vystaveno magnetickému poli.Neošetřená celá zvířata byla použita jako kontroly (pozadí).Kromě toho byla použita zvířata, kterým bylo injikováno 0,1 ml MNP, ale bez implantace magnetů (MNPs-ICG + tumor-BM).
Vizualizace fluorescence vzorků in vivo a in vitro byla provedena na bioimageru IVIS Lumina LT série III (PerkinElmer Inc., USA).Pro in vitro vizualizaci byl do jamek destičky přidán objem 1 ml syntetického PLA-EDA-ICG a konjugátu MNP-PLA-EDA-ICG.S přihlédnutím k fluorescenčním charakteristikám barviva ICG je vybrán nejlepší filtr použitý ke stanovení intenzity světla vzorku: maximální excitační vlnová délka je 745 nm a emisní vlnová délka je 815 nm.Ke kvantitativnímu měření intenzity fluorescence jamek obsahujících konjugát byl použit software Living Image 4.5.5 (PerkinElmer Inc.).
Intenzita fluorescence a akumulace konjugátu MNP-PLA-EDA-ICG byly měřeny u myší s nádorovým modelem in vivo, bez přítomnosti a aplikace magnetického pole v místě zájmu.Myši byly anestetizovány isofluranem a poté bylo do ocasní žíly injikováno 0,1 ml konjugátu MNP-PLA-EDA-ICG.Neošetřené myši byly použity jako negativní kontrola pro získání fluorescenčního pozadí.Po intravenózním podání konjugátu umístěte zvíře na zahřívací stolek (37 °C) v komoře fluorescenčního zobrazovače IVIS Lumina LT série III (PerkinElmer Inc.), přičemž udržujte inhalaci s 2% anestetizací isofluranem.Použijte vestavěný filtr ICG (745–815 nm) pro detekci signálu 1 minutu a 15 minut po zavedení MNP.
Pro posouzení akumulace konjugátu v nádoru byla peritoneální oblast zvířete pokryta papírem, což umožnilo eliminovat jasnou fluorescenci spojenou s akumulací částic v játrech.Po prostudování biodistribuce MNP-PLA-EDA-ICG byla zvířata humánně usmrcena předávkováním isofluranovou anestezií pro následné oddělení oblastí tumoru a kvantitativní hodnocení fluorescenčního záření.Použijte software Living Image 4.5.5 (PerkinElmer Inc.) k ručnímu zpracování analýzy signálu z vybrané oblasti zájmu.Pro každé zvíře byla provedena tři měření (n = 9).
V této studii jsme nekvantifikovali úspěšnou zátěž ICG na MNPs-ICG.Navíc jsme neporovnávali retenční účinnost nanočástic pod vlivem permanentních magnetů různých tvarů.Navíc jsme nehodnotili dlouhodobý vliv magnetického pole na retenci nanočástic v nádorových tkáních.
Dominují nanočástice s průměrnou velikostí 195,4 nm.Kromě toho suspenze obsahovala aglomeráty s průměrnou velikostí 1176,0 nm (obrázek 5A).Následně byla část zfiltrována přes odstředivý filtr.Zeta potenciál částic je -15,69 mV (obrázek 5B).
Obrázek 5 Fyzikální vlastnosti suspenze: (A) distribuce velikosti částic;(B) distribuce částic při zeta potenciálu;(C) TEM fotografie nanočástic.
Velikost částic je v podstatě 200 nm (obrázek 5C), skládá se z jednoho MNP o velikosti 20 nm a organického obalu konjugovaného PLA-EDA-ICG s nižší elektronovou hustotou.Vznik aglomerátů ve vodných roztocích lze vysvětlit relativně nízkým modulem elektromotorické síly jednotlivých nanočástic.
U permanentních magnetů, kdy je magnetizace soustředěna do objemu V, je integrální vyjádření rozděleno na dva integrály, a to na objem a povrch:
V případě vzorku s konstantní magnetizací je proudová hustota nulová.Pak bude vyjádření vektoru magnetické indukce mít následující podobu:
Pro numerický výpočet použijte program MATLAB (MathWorks, Inc., USA), akademické licenční číslo ETU „LETI“ 40502181.
Jak ukazuje obrázek 7 Obrázek 8 Obrázek 9 Obrázek-10, nejsilnější magnetické pole je generováno magnetem orientovaným axiálně od konce válce.Efektivní akční rádius je ekvivalentní geometrii magnetu.U válcových magnetů s válcem, jehož délka je větší než jeho průměr, je nejsilnější magnetické pole pozorováno v axiálně-radiálním směru (pro odpovídající složku);proto je nejúčinnější dvojice válců s větším poměrem stran (průměr a délka) MNP adsorpce.
Obr. 7 Složka intenzity magnetické indukce Bz podél osy Oz magnetu;standardní velikost magnetu: černá linka 0,5×2mm, modrá linka 2×2mm, zelená linka 3×2mm, červená linka 5×2mm.
Obrázek 8 Magnetická indukční složka Br je kolmá k ose magnetu Oz;standardní velikost magnetu: černá linka 0,5×2mm, modrá linka 2×2mm, zelená linka 3×2mm, červená linka 5×2mm.
Obrázek 9 Složka intenzity magnetické indukce Bz ve vzdálenosti r od koncové osy magnetu (z=0);standardní velikost magnetu: černá linka 0,5×2mm, modrá linka 2×2mm, zelená linka 3×2mm, červená linka 5×2mm.
Obrázek 10 Složka magnetické indukce v radiálním směru;standardní velikost magnetu: černá linka 0,5×2mm, modrá linka 2×2mm, zelená linka 3×2mm, červená linka 5×2mm.
Pomocí speciálních hydrodynamických modelů lze studovat způsob dodávání MNP do nádorových tkání, koncentrovat nanočástice v cílové oblasti a určit chování nanočástic za hydrodynamických podmínek v oběhovém systému.Permanentní magnety lze použít jako vnější magnetická pole.Pokud pomineme magnetostatickou interakci mezi nanočásticemi a neuvažujeme model magnetické tekutiny, stačí odhadnout interakci mezi magnetem a jednou nanočásticí s dipól-dipólovou aproximací.
Kde m je magnetický moment magnetu, r je vektor poloměru bodu, kde se nachází nanočástice, a k je systémový faktor.V dipólové aproximaci má pole magnetu podobnou konfiguraci (obrázek 11).
V rovnoměrném magnetickém poli se nanočástice otáčejí pouze podél siločar.V nerovnoměrném magnetickém poli na něj působí síla:
Kde je derivace daného směru l.Síla navíc vtahuje nanočástice do nejnerovnějších oblastí pole, to znamená, že zakřivení a hustota siločar se zvětšují.
Proto je žádoucí použít dostatečně silný magnet (nebo magnetový řetěz) se zřejmou axiální anizotropií v oblasti, kde se částice nacházejí.
Tabulka 1 ukazuje schopnost jediného magnetu jako dostatečného zdroje magnetického pole zachytit a udržet MNP v cévním řečišti aplikačního pole.