Javascript je ve vašem prohlížeči momentálně zakázán. Pokud je javascript zakázán, některé funkce těchto webových stránek nebudou fungovat.
Zaregistrujte své konkrétní údaje a konkrétní léky, o které máte zájem, a my vámi poskytnuté informace porovnáme s články v naší rozsáhlé databázi a včas vám e-mailem zašleme kopii ve formátu PDF.
Řízení pohybu magnetických nanočástic oxidu železa pro cílené dodávání cytostatik
Autor Toropova Y, Korolev D, Istomina M, Shulmeyster G, Petukhov A, Mishanin V, Gorshkov A, Podyacheva E, Gareev K, Bagrov A, Demidov O
Jana Toropovová,1 Dmitrij Koroljov,1 Marija Istomina,1,2 Galina Šulmejsterová,1 Alexej Petuchov,1,3 Vladimir Mišanin,1 Andrej Gorškov,4 Jekatěrina Podjačeva,1 Kamil Garejev,2 Alexej Bagrov,5 Oleg Děmidov6,71 Národní lékařské výzkumné centrum Almazov Ministerstva zdravotnictví Ruské federace, Petrohrad, 197341, Ruská federace; 2 Petrohradská elektrotechnická univerzita „LETI“, Petrohrad, 197376, Ruská federace; 3 Centrum personalizované medicíny, Almazovovo státní lékařské výzkumné centrum, Ministerstvo zdravotnictví Ruské federace, Petrohrad, 197341, Ruská federace; 4FSBU „Výzkumný ústav chřipky jménem A. A. Smorodincev“ Ministerstvo zdravotnictví Ruské federace, Petrohrad, Ruská federace; 5 Sečenovův ústav evoluční fyziologie a biochemie Ruské akademie věd, Petrohrad, Ruská federace; 6 Cytologický ústav RAS, Petrohrad, 194064, Ruská federace; 7INSERM U1231, Lékařská a farmaceutická fakulta, Univerzita Bourgogne-Franche Comté v Dijonu, Francie Komunikace: Yana Toropova, Národní lékařské výzkumné centrum Almazov, Ministerstvo zdravotnictví Ruské federace, Petrohrad, 197341, Ruská federace Tel +7 981 95264800 4997069 Email [email protected] Souvislosti: Slibným přístupem k problému cytostatické toxicity je použití magnetických nanočástic (MNP) pro cílené podávání léků. Účel: Pomocí výpočtů určit nejlepší charakteristiky magnetického pole, které řídí MNP in vivo, a vyhodnotit účinnost magnetronového podávání MNP do myších nádorů in vitro a in vivo. Používá se metoda MNPs-ICG. Studie intenzity luminiscence in vivo byly provedeny na myších s nádorem, s magnetickým polem a bez něj v místě zájmu. Tyto studie byly provedeny na hydrodynamickém scaffoldu vyvinutém Institutem experimentální medicíny Almazovova státního lékařského výzkumného centra ruského ministerstva zdravotnictví. Výsledek: Použití neodymových magnetů podpořilo selektivní akumulaci MNP. Minutu po podání MNPs-ICG myším s nádorem se MNPs-ICG akumuluje převážně v játrech. V přítomnosti i nepřítomnosti magnetického pole to naznačuje jeho metabolickou dráhu. Ačkoli byl v přítomnosti magnetického pole pozorován nárůst fluorescence v nádoru, intenzita fluorescence v játrech zvířete se v průběhu času neměnila. Závěr: Tento typ MNP v kombinaci s vypočítanou intenzitou magnetického pole může být základem pro vývoj magneticky řízeného podávání cytostatik do nádorových tkání. Klíčová slova: fluorescenční analýza, indocyanin, nanočástice oxidu železa, magnetronové podávání cytostatik, cílení na nádor
Nádorová onemocnění jsou jednou z hlavních příčin úmrtí na celém světě. Zároveň stále přetrvává dynamika rostoucí morbidity a mortality nádorových onemocnění. 1 Chemoterapie používaná dnes je stále jednou z hlavních léčebných metod pro různé nádory. Zároveň je vývoj metod ke snížení systémové toxicity cytostatik stále relevantní. Slibnou metodou řešení problému toxicity je použití nanoměřítkových nosičů k cílenému podávání léků, které mohou zajistit lokální akumulaci léčiv v nádorových tkáních, aniž by se zvýšila jejich akumulace ve zdravých orgánech a tkáních. 2 Tato metoda umožňuje zlepšit účinnost a cílení chemoterapeutických léčiv na nádorové tkáně a zároveň snížit jejich systémovou toxicitu.
Mezi různými nanočásticemi zvažovanými pro cílené podávání cytostatik jsou magnetické nanočástice (MNP) obzvláště zajímavé kvůli svým jedinečným chemickým, biologickým a magnetickým vlastnostem, které zajišťují jejich všestrannost. Magnetické nanočástice proto mohou být použity jako topný systém k léčbě nádorů s hypertermií (magnetická hypertermie). Mohou být také použity jako diagnostické látky (magnetická rezonance).3-5 Využití těchto vlastností v kombinaci s možností akumulace MNP ve specifické oblasti pomocí vnějšího magnetického pole otevírá cílené podávání farmaceutických přípravků možnosti vytvoření multifunkčního magnetronového systému pro cílené podávání cytostatik do místa nádoru. Takový systém by zahrnoval MNP a magnetická pole pro řízení jejich pohybu v těle. V tomto případě lze jako zdroj magnetického pole použít jak vnější magnetická pole, tak magnetické implantáty umístěné v oblasti těla obsahující nádor.6 První metoda má vážné nedostatky, včetně potřeby použití specializovaného vybavení pro magnetické cílení léků a potřeby zaškolení personálu k provádění chirurgických zákroků. Tato metoda je navíc omezena vysokými náklady a je vhodná pouze pro „povrchové“ nádory blízko povrchu těla. Alternativní metoda použití magnetických implantátů rozšiřuje rozsah použití této technologie a usnadňuje její využití u nádorů umístěných v různých částech těla. Jako implantáty pro poškození nádoru v dutých orgánech a zajištění jejich průchodnosti lze použít jak jednotlivé magnety, tak magnety integrované do intraluminálního stentu. Nicméně podle našeho vlastního nepublikovaného výzkumu nejsou tyto magnety dostatečně magnetické, aby zajistily zadržení MNP v krevním řečišti.
Účinnost magnetronového podávání léčiv závisí na mnoha faktorech: vlastnostech samotného magnetického nosiče a vlastnostech zdroje magnetického pole (včetně geometrických parametrů permanentních magnetů a síly magnetického pole, které generují). Vývoj úspěšné technologie magneticky naváděného podávání buněčných inhibitorů by měl zahrnovat vývoj vhodných magnetických nanoměřítkových nosičů léčiv, posouzení jejich bezpečnosti a vývoj vizualizačního protokolu, který umožňuje sledování jejich pohybu v těle.
V této studii jsme matematicky vypočítali optimální charakteristiky magnetického pole pro řízení magnetického nanoměřítka nosiče léčiv v těle. Možnost zadržení nanočástic (MNP) skrz cévní stěnu pod vlivem aplikovaného magnetického pole s těmito výpočetními charakteristikami byla také studována na izolovaných cévách potkanů. Dále jsme syntetizovali konjugáty MNP a fluorescenčních činidel a vyvinuli protokol pro jejich vizualizaci in vivo. Za podmínek in vivo byla na myších s nádorovým modelem studována účinnost akumulace MNP v nádorových tkáních při systémovém podávání pod vlivem magnetického pole.
Ve studii in vitro jsme použili referenční MNP a ve studii in vivo jsme použili MNP potažený polyesterem kyseliny mléčné (polymléčná kyselina, PLA) obsahujícím fluorescenční činidlo (indolecyanin; ICG). V tomto případě je MNP-ICG zahrnut v (MNP-PLA-EDA-ICG).
Syntéza a fyzikální a chemické vlastnosti MNP byly podrobně popsány jinde. 7,8
Pro syntézu MNPs-ICG byly nejprve vyrobeny konjugáty PLA-ICG. Byla použita prášková racemická směs PLA-D a PLA-L s molekulovou hmotností 60 kDa.
Protože PLA i ICG jsou kyseliny, je pro syntézu konjugátů PLA-ICG nejprve nutné syntetizovat amino-terminální spacer na PLA, který pomáhá ICG chemisorbovat se na spacer. Spacer byl syntetizován za použití ethylendiaminu (EDA), karbodiimidové metody a ve vodě rozpustného karbodiimidu, 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) karbodiimidu (EDAC). Spacer PLA-EDA se syntetizuje následovně. Do 2 ml chloroformového roztoku PLA o koncentraci 0,1 g/ml se přidá 20násobný molární přebytek EDA a 20násobný molární přebytek EDAC. Syntéza byla provedena v 15ml polypropylenové zkumavce na třepačce rychlostí 300 min-1 po dobu 2 hodin. Schéma syntézy je znázorněno na obrázku 1. Pro optimalizaci schématu syntézy syntézu opakujte s 200násobným přebytkem činidel.
Na konci syntézy byl roztok centrifugován při rychlosti 3000 min-1 po dobu 5 minut, aby se odstranily přebytečné vysrážené deriváty polyethylenu. Poté byly k 2 ml roztoku přidány 2 ml roztoku ICG v dimethylsulfoxidu (DMSO) o koncentraci 0,5 mg/ml. Míchadlo bylo po dobu 2 hodin zapnuto na rychlost míchání 300 min-1. Schéma získaného konjugátu je znázorněno na obrázku 2.
Do 200 mg MNP jsme přidali 4 ml konjugátu PLA-EDA-ICG. Suspenze se míchala 30 minut na třepačce LS-220 (LOIP, Rusko) při frekvenci 300 min-1. Poté byla třikrát promyta isopropanolem a podrobena magnetické separaci. Pomocí ultrazvukového dispergátoru UZD-2 (FSUE NII TVCH, Rusko) se k suspenzi přidával IPA po dobu 5-10 minut za kontinuálního působení ultrazvuku. Po třetím promytí IPA byla sraženina promyta destilovanou vodou a resuspendována ve fyziologickém roztoku o koncentraci 2 mg/ml.
Pro studium distribuce velikosti získaných nanočástic (Malvern Instruments, Velká Británie) byl použit přístroj ZetaSizer Ultra (Malvern Instruments, Velká Británie). Pro studium tvaru a velikosti nanočástic byl použit transmisní elektronový mikroskop (TEM) s katodou s polní emisí JEM-1400 STEM (JEOL, Japonsko).
V této studii používáme válcové permanentní magnety (jakosti N35; s ochranným niklovým povlakem) a následující standardní velikosti (délka dlouhé osy × průměr válce): 0,5×2 mm, 2×2 mm, 3×2 mm a 5×2 mm.
Studie transportu MNP in vitro v modelovém systému byla provedena na hydrodynamickém scaffoldu vyvinutém Ústavem experimentální medicíny Almazovova státního lékařského výzkumného centra ruského ministerstva zdravotnictví. Objem cirkulující kapaliny (destilovaná voda nebo Krebsův-Henseleitův roztok) je 225 ml. Jako permanentní magnety se používají axiálně magnetizované válcové magnety. Magnet se umístí na držák 1,5 mm od vnitřní stěny centrální skleněné trubice tak, aby jeho konec směřoval ke směru trubice (vertikálně). Průtok kapaliny v uzavřené smyčce je 60 l/h (což odpovídá lineární rychlosti 0,225 m/s). Krebsův-Henseleitův roztok se používá jako cirkulující kapalina, protože je analogem plazmatu. Koeficient dynamické viskozity plazmatu je 1,1–1,3 mPa∙s. 9 Množství MNP adsorbovaného v magnetickém poli se po experimentu stanoví spektrofotometricky z koncentrace železa v cirkulující kapalině.
Kromě toho byly provedeny experimentální studie na vylepšeném stole mechaniky tekutin za účelem stanovení relativní propustnosti cév. Hlavní komponenty hydrodynamické podpory jsou znázorněny na obrázku 3. Hlavními komponenty hydrodynamického stentu jsou uzavřená smyčka, která simuluje průřez modelového cévního systému, a zásobní nádrž. Pohyb modelové tekutiny podél obrysu modulu cév zajišťuje peristaltické čerpadlo. Během experimentu je třeba udržovat odpařování a požadovaný teplotní rozsah a sledovat parametry systému (teplotu, tlak, průtok kapaliny a hodnotu pH).
Obrázek 3 Blokové schéma zařízení použitého ke studiu propustnosti stěny karotické tepny. 1 - zásobní nádrž, 2 - peristaltické čerpadlo, 3 - mechanismus pro zavádění suspenze obsahující MNP do smyčky, 4 - průtokoměr, 5 - tlakový senzor ve smyčce, 6 - výměník tepla, 7 - komora s nádobou, 8 - zdroj magnetického pole, 9 - balónek s uhlovodíky.
Komora obsahující nádobu se skládá ze tří nádob: vnější velké nádoby a dvou malých nádob, kterými procházejí ramena centrálního okruhu. Kanyla se zasune do malé nádoby, nádoba se navleče na malou nádobu a hrot kanyly se pevně sváže tenkým drátem. Prostor mezi velkou a malou nádobou je naplněn destilovanou vodou a teplota zůstává konstantní díky připojení k výměníku tepla. Prostor v malé nádobě je naplněn Krebs-Henseleitovým roztokem pro udržení životaschopnosti cévních buněk. Nádrž je také naplněna Krebs-Henseleitovým roztokem. Systém přívodu plynu (uhlíku) se používá k odpařování roztoku v malé nádobě v zásobní nádrži a komoře obsahující nádobu (obrázek 4).
Obrázek 4 Komora, ve které je umístěna nádoba. 1 - Kanyla pro spuštění cév, 2 - Vnější komora, 3 - Malá komora. Šipka označuje směr modelové tekutiny.
Pro stanovení indexu relativní propustnosti cévní stěny byla použita karotická tepna krysy.
Zavedení suspenze MNP (0,5 ml) do systému má následující charakteristiky: celkový vnitřní objem nádrže a spojovacího potrubí ve smyčce je 20 ml a vnitřní objem každé komory je 120 ml. Zdrojem externího magnetického pole je permanentní magnet o standardní velikosti 2×3 mm. Je instalován nad jednou z malých komor, 1 cm od nádoby, jedním koncem směřujícím ke stěně nádoby. Teplota je udržována na 37 °C. Výkon válečkového čerpadla je nastaven na 50 %, což odpovídá rychlosti 17 cm/s. Jako kontrola byly vzorky odebrány v cele bez permanentních magnetů.
Hodinu po podání dané koncentrace MNP byl z komory odebrán kapalný vzorek. Koncentrace částic byla měřena spektrofotometrem Unico 2802S UV-Vis spektrofotometr (United Products & Instruments, USA). S ohledem na absorpční spektrum suspenze MNP bylo měření provedeno při 450 nm.
V souladu s pokyny Rus-LASA-FELASA jsou všechna zvířata chována ve specifických zařízeních bez patogenů. Tato studie splňuje všechny příslušné etické předpisy pro pokusy a výzkum na zvířatech a získala etické schválení od Národního lékařského výzkumného centra Almazov (IACUC). Zvířata pila vodu ad libitum a byla pravidelně krmena.
Studie byla provedena na 10 anestetizovaných 12 týdnů starých samcích imunodeficientních myší NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/Szj, Jackson Laboratory, USA) o hmotnosti 22 g ± 10 %. Vzhledem k tomu, že imunita imunodeficientních myší je potlačena, imunodeficientní myši této linie umožňují transplantaci lidských buněk a tkání bez odmítnutí transplantátu. Sourozenci z různých klecí byli náhodně zařazeni do experimentální skupiny a byli společně kříženi nebo systematicky vystavováni podestýlce jiných skupin, aby byla zajištěna stejná expozice společné mikrobiotě.
Lidská rakovinná buněčná linie HeLa se používá k vytvoření xenograftového modelu. Buňky byly kultivovány v DMEM obsahujícím glutamin (PanEco, Rusko), doplněném 10% fetálním bovinním sérem (Hyclone, USA), 100 CFU/ml penicilinu a 100 μg/ml streptomycinu. Buněčná linie byla laskavě poskytnuta Laboratoří regulace genové exprese Ústavu buněčného výzkumu Ruské akademie věd. Před injekcí byly buňky HeLa odstraněny z kultivačního plastu roztokem trypsinu:Versene 1:1 (Biolot, Rusko). Po promytí byly buňky suspendovány v kompletním médiu na koncentraci 5×106 buněk na 200 μl a zředěny matricí bazální membrány (LDEV-FREE, MATRIGEL® CORNING®) (1:1, na ledu). Připravená buněčná suspenze byla injikována subkutánně do kůže stehna myši. Růst nádoru se sleduje elektronickými kalipery každé 3 dny.
Když nádor dosáhl velikosti 500 mm3, byl do svalové tkáně experimentálního zvířete v blízkosti nádoru implantován permanentní magnet. V experimentální skupině (MNPs-ICG + nádor-M) bylo injekčně podáno 0,1 ml suspenze MNP a vystaveno magnetickému poli. Jako kontrola (pozadí) byla použita neošetřená celá zvířata. Dále byla použita zvířata, kterým bylo injekčně podáno 0,1 ml MNP, ale nebyly jim implantovány magnety (MNPs-ICG + nádor-BM).
Fluorescenční vizualizace vzorků in vivo a in vitro byla provedena na bioimageru IVIS Lumina LT řady III (PerkinElmer Inc., USA). Pro vizualizaci in vitro byl do jamek destičky přidán objem 1 ml syntetického konjugátu PLA-EDA-ICG a MNP-PLA-EDA-ICG. S ohledem na fluorescenční charakteristiky barviva ICG byl zvolen nejlepší filtr použitý pro stanovení intenzity světla vzorku: maximální excitační vlnová délka je 745 nm a emisní vlnová délka je 815 nm. Pro kvantitativní měření intenzity fluorescence jamek obsahujících konjugát byl použit software Living Image 4.5.5 (PerkinElmer Inc.).
Intenzita fluorescence a akumulace konjugátu MNP-PLA-EDA-ICG byly měřeny u myší s nádorovým modelem in vivo, bez přítomnosti a aplikace magnetického pole v místě zájmu. Myši byly anestetizovány isofluranem a poté jim bylo do ocasní žíly injekčně podáno 0,1 ml konjugátu MNP-PLA-EDA-ICG. Neošetřené myši byly použity jako negativní kontrola pro získání fluorescenčního pozadí. Po intravenózním podání konjugátu byly zvířata umístěna na ohřívací plochu (37 °C) v komoře fluorescenčního zobrazovače IVIS Lumina LT řady III (PerkinElmer Inc.) za současné inhalace s 2% anestezií isofluranem. Pro detekci signálu použijte vestavěný filtr ICG (745–815 nm) 1 minutu a 15 minut po zavedení MNP.
Pro posouzení akumulace konjugátu v nádoru byla peritoneální oblast zvířete zakryta papírem, což umožnilo eliminovat jasnou fluorescenci spojenou s akumulací částic v játrech. Po prostudování biodistribuce MNP-PLA-EDA-ICG byla zvířata humánně utracena předávkováním isofluranem v anestezii pro následné oddělení nádorových oblastí a kvantitativní vyhodnocení fluorescenčního záření. Pro ruční zpracování analýzy signálu z vybrané oblasti zájmu byl použit software Living Image 4.5.5 (PerkinElmer Inc.). U každého zvířete (n = 9) byla provedena tři měření.
V této studii jsme nekvantifikovali úspěšnost nanášení ICG na MNPs-ICG. Dále jsme neporovnávali účinnost retence nanočástic pod vlivem permanentních magnetů různých tvarů. Dále jsme nehodnotili dlouhodobý vliv magnetického pole na retenci nanočástic v nádorových tkáních.
Dominují nanočástice s průměrnou velikostí 195,4 nm. Suspenze navíc obsahovala aglomeráty s průměrnou velikostí 1176,0 nm (obrázek 5A). Následně byla část filtrována přes odstředivý filtr. Zeta potenciál částic je -15,69 mV (obrázek 5B).
Obrázek 5 Fyzikální vlastnosti suspenze: (A) distribuce velikosti částic; (B) distribuce částic na zeta potenciálu; (C) TEM fotografie nanočástic.
Velikost částic je v podstatě 200 nm (obrázek 5C), složené z jediné nanočástice o velikosti 20 nm a konjugované organické slupky PLA-EDA-ICG s nižší elektronovou hustotou. Vznik aglomerátů ve vodných roztocích lze vysvětlit relativně nízkým modulem elektromotorické síly jednotlivých nanočástic.
U permanentních magnetů, když je magnetizace soustředěna v objemu V, se integrální výraz rozdělí na dva integrály, a to objemový a povrchový:
V případě vzorku s konstantní magnetizací je hustota proudu nulová. Výraz vektoru magnetické indukce pak bude mít následující tvar:
Pro numerické výpočty použijte program MATLAB (MathWorks, Inc., USA), akademická licence ETU „LETI“ číslo 40502181.
Jak je znázorněno na obrázku 7, obrázku 8 a obrázku 9, nejsilnější magnetické pole je generováno magnetem orientovaným axiálně od konce válce. Efektivní akční poloměr je ekvivalentní geometrii magnetu. U válcových magnetů s válcem, jehož délka je větší než jeho průměr, je nejsilnější magnetické pole pozorováno v axiálně-radiálním směru (pro odpovídající složku); proto je nejúčinnější adsorpce MNP u dvojice válců s větším poměrem stran (průměr a délka).
Obr. 7 Složka intenzity magnetické indukce Bz podél osy Oz magnetu; standardní rozměr magnetu: černá čára 0,5×2 mm, modrá čára 2×2 mm, zelená čára 3×2 mm, červená čára 5×2 mm.
Obrázek 8 Složka magnetické indukce Br je kolmá k ose magnetu Oz; standardní rozměry magnetu: černá čára 0,5×2 mm, modrá čára 2×2 mm, zelená čára 3×2 mm, červená čára 5×2 mm.
Obrázek 9 Složka intenzity magnetické indukce Bz ve vzdálenosti r od koncové osy magnetu (z=0); standardní rozměr magnetu: černá čára 0,5×2 mm, modrá čára 2×2 mm, zelená čára 3×2 mm, červená čára 5×2 mm.
Obrázek 10 Magnetická indukční složka podél radiálního směru; standardní velikost magnetu: černá čára 0,5×2 mm, modrá čára 2×2 mm, zelená čára 3×2 mm, červená čára 5×2 mm.
Speciální hydrodynamické modely lze použít ke studiu způsobu dodávání MNP do nádorových tkání, koncentraci nanočástic v cílové oblasti a určení chování nanočástic za hydrodynamických podmínek v oběhovém systému. Jako vnější magnetická pole lze použít permanentní magnety. Pokud ignorujeme magnetostatickou interakci mezi nanočásticemi a neuvažujeme model magnetické tekutiny, postačí odhadnout interakci mezi magnetem a jednou nanočásticí pomocí dipól-dipólové aproximace.
Kde m je magnetický moment magnetu, r je poloměrový vektor bodu, kde se nanočástice nachází, a k je systémový faktor. V dipólové aproximaci má pole magnetu podobnou konfiguraci (obrázek 11).
V rovnoměrném magnetickém poli se nanočástice otáčejí pouze podél siločar. V nerovnoměrném magnetickém poli na ně působí síla:
Kde je derivace daného směru l. Kromě toho síla vtahuje nanočástice do nejnerovnoměrnějších oblastí pole, tj. zakřivení a hustota siločar se zvětšují.
Proto je žádoucí použít dostatečně silný magnet (nebo magnetický řetězec) se zjevnou axiální anizotropií v oblasti, kde se částice nacházejí.
Tabulka 1 ukazuje schopnost jediného magnetu jako dostatečného zdroje magnetického pole zachytit a udržet MNP v cévním řečišti aplikačního pole.